肝素免疫亲和柱说明书

　　肝素免疫亲和柱说明书

　　1、用途：

　　肝素亲和柱可特异吸附乳铁蛋白，试样中铁蛋白经缓冲液提取，用肝素亲和柱净化后的样品液可直接用于HPLC分析。

　　肝素亲和柱与HPLC配合使用可达到快速测定的目的，以改善信噪比，可提高检测方法的准确度。

　　2、概述：

　　乳铁蛋白（Lactoferrin,Lf）是一种主要存在于哺乳动物乳汁中的糖蛋白，相对分子量约为80KDa，乳铁蛋白在体内不仅参与铁的转运，还具有抗菌、抗病毒、抗氧化和免疫调节的功能。被认为是一种新型的抗菌、抗癌药物和具有开发潜力的食品和饲料添加剂。目前已被广泛添加于婴幼儿食品中。

　　3、原理：

　　肝素免疫亲和柱能够特异性的纯化样品中的乳铁蛋白，样品前处理后，通过免疫亲和柱净化，乳铁蛋白特异性吸附在亲和柱上，用淋洗液将免疫亲合柱上的杂质除去，用洗脱液通过分离柱，将乳铁蛋白亲和柱上分离下来，最后，将洗脱液注入HPLC或LC-MS进行测定。

　　4、包装组成：

　　每一个盒中包括各种规格的肝素亲和柱及1份说明书。

　　5、注意事项：

　　----使用前，亲和柱需回至室温（18～25℃）。

　　----亲和柱2～8℃储存，不得冻存；冰箱内建议不要贴壁放置，产品易冻，影响性能！

　　----请在有效日期内使用亲和柱。

　　----取样量：根据需要可以适当增加或减少取样量，注意提取液量要相应改变。

　　----柱容量：5mg，当样本中待检乳铁蛋白的含量除以稀释倍数高于柱容量时，需要适当降低上样液的体积，

　　----样品的净化过程中勿将亲和柱内的液体抽干，避免气体进入到亲和柱的填料中。

　　----腐蚀性较强，使用过程中注意防护。

　　6、配制溶液：

　　6.1磷酸盐缓冲液Ⅰ（洗脱液）:称取7.1g磷酸氢二钠、58.4g氯化钠,加900mL水溶解,用磷酸调pH至8.0±0.2,加水定容至1000mL。

　　6.2磷酸盐缓冲液Ⅱ（提取液）:称取30.1g十二水合磷酸氢二钠，2.5g二水合磷酸二氢钠,加900mL水溶解,然后加入20ml乳铁蛋白提取试剂,加水定容至1000mL

　　6.3磷酸盐缓冲液Ⅲ（淋洗液）::称取30.1g十二水合磷酸氢二钠，2.5g二水合磷酸二氢钠,加900mL水溶解并定容至1000mL。

　　6.4磷酸盐缓冲液Ⅳ（国标提取液）：

　　称取71.6g十二水合磷酸氢二钠（或28.4g磷酸氢二钠），

　　加入900mL去离子水溶解并用磷酸调pH至7.5±0.2，最后用水定容至1000mL。

　　7、样品处理：

　　固态试样(调制乳粉、乳基婴幼儿配方食品

　　方法一（同国标方法）：

　　----称取2.5g(准确至0.01g)试样于烧杯中,加入温热(温度不超过50℃)的磷酸盐缓冲液Ⅳ,搅拌使样品溶解,冷却至室温。

　　----分次将样品转移至50mL容量瓶并用磷酸盐缓冲液Ⅳ定容至刻度,充分混匀后转入离心管中，取40.0mL溶液在4℃条件下10000r/min离心8min,取10ml上清液作为上样液待净化。

　　稀释倍数：2

　　方法二：

　　----称取2.5g(准确至0.01g)试样于烧杯中,加入温热(温度不超过50℃)的磷酸盐缓冲液Ⅱ,搅拌使样品溶解,冷却至室温。

　　----分次将样品转移至50mL容量瓶并用磷酸盐缓冲液Ⅱ定容至刻度,充分混匀后转入离心管中，取40.0mL溶液在4℃条件下10000r/min离心8min,取10ml上清液作为上样液待净化。

　　稀释倍数：2

　　液态试样(巴氏杀菌乳、调制乳、含乳饮料)

　　方法一（同国标方法）：

　　----称取5g(准确至0.01g)试样于烧杯中,加入适量磷酸盐缓冲液Ⅳ提取,分次将样品转移至25mL容量瓶,用磷酸盐缓冲液Ⅳ定容至刻度。

　　----充分混匀后转入离心管,在4℃条件下10000r/min离心8min,取10ml上清液作为上样液待净化，

　　稀释倍数：0.5

　　方法二：

　　----称取5g(精确至0.01g)试样于烧杯中,加入适量磷酸盐缓冲液Ⅱ提取,分次将样品转移至25mL容量瓶,用磷酸盐缓冲液Ⅱ定容至刻度。

　　----充分混匀后转入离心管,在4℃条件下10000r/min离心8min,取10ml上清液作为上样液待净化，

　　稀释倍数：0.5

　　含水解蛋白跟乳清蛋白的配方奶粉

　　----称取0.5g(准确至0.01g)试样于烧杯中,加入适量磷酸盐缓冲液Ⅱ提取,分次将样品转移至50mL容量瓶,用磷酸盐缓冲液Ⅱ定容至刻度。

　　----充分混匀后转入离心管,在4℃条件下10000r/min离心8min,取20ml上清液作为上样液待净化。

　　稀释倍数：5

　　8、操作程序：

　　----取出免疫亲和柱，3mL的免疫亲和柱将注射器筒的下端直接穿透亲和柱上方的塞子，完成注射器筒与亲和柱的连接，将柱子与气控操作架上的注射器连接固定，12ml直接拔掉上盖；

　　----去掉亲和柱下方堵头（洗脱需使用，勿丢弃），调节开关，使液体以1滴/秒的速度流出；

　　----肝素亲和柱先用10mL磷酸缓冲液Ⅱ活化，取7中上样液过柱；

　　----固态试样(调制乳粉、乳基婴幼儿配方食品及液态试样(巴氏杀菌乳、调制乳、含乳饮料)用10mL磷酸缓冲液Ⅳ淋洗，用5mL磷酸缓冲液Ⅰ洗脱，收集洗脱液，用磷酸缓冲液Ⅰ定容至5mL，涡旋混匀，过微孔滤膜后待测；

　　----含水解蛋白跟乳清蛋白的配方奶粉用20mL磷酸缓冲液Ⅲ淋洗，用5mL磷酸缓冲液Ⅰ洗脱，收集洗脱液，用磷酸缓冲液Ⅰ定容至5mL，涡旋混匀，过微孔滤膜后待测；

　　9、结果判读：

　　肝素的含量=检测浓度×稀释倍数×5

　　10、贮藏条件及有效期：

　　贮藏条件：2～8℃。

　　有效期：该产品有效期为18个月。

　　11、亲和柱再生：

　　11.1亲和柱洗脱完毕至再生，期间应放置入2-8℃环境中，时间不超过30分钟。

　　11.2依次使用10mL磷酸缓冲液Ⅰ，10mL磷酸缓冲液Ⅲ，10mL纯水，10mL20%乙醇淋洗亲和柱。

　　11.3加入3mL20%乙醇并塞住亲和柱两端开口，于2-8℃环境中保存。

　　11.4该亲和柱可至少再生2次。